Locke fikk sin tidlige utdanning i fødebyens kirkekor, som ble ledet av Orlando Gibbons' bror Edward. Senere studerte Locke hos William Wake. I 1648 foretok han en reise til Nederland, hvor han muligens konverterte til katolisismen. I 1661 ble han hoffkomponist hos kong Charles II, og snart også kongens organist.
Sammen med Christopher Gibbons (Orlandos sønn) skrev Locke musikken til maskespillet Cupid and Death (1653) av dramatikeren James Shirley. Partituret for dette verket er det eneste bevarte partituret for dramatisk musikk fra denne perioden.[8] Locke var en av fem komponister som skrev musikk til William Davenants gjennombruddsopera, The Siege of Rhodes (1656).[9] Locke skrev musikk for Davenants etterfølgende operaer også, The Cruelty of the Spaniards in Peru (1658) og The History of Sir Francis Drake (1659).[10] Han skrev også musikken til prosesjonsmarsjen under kong Charles IIs kroning.[11]
Lockes musikkteoretiske verk, Melothesia, ble publisert i 1673. Tittelsiden beskriver ham som "Composer in Ordinary to His Majesty, and organist of her Majesty's chapel" – monarkene er Charles II og Katarina av Braganza. Locke komponerte også musikk for blåseinstrumenter («music for the King's sackbutts and cornets»), og fiolinmusikk. I 1674 ble Lockes verk Macbeth (William Davenant) og The Tempest (Thomas Shadewell) uroppført, og i 1675 komponerte han musikk for Thomas ShadwellsPsyche.