Kapacitace

Kapacitace je označení maturačních změn spermie, které probíhají v pohlavním traktu samice u savců. Po ejakulaci je spermie neschopná oplodnění, k tomu je zapotřebí, aby určitou (pro každý druh specifickou) dobu pobývala v reprodukčním traktu samice, kde interaguje se složkami oviduktální tekutiny (např. sérový albumin, lipoproteinové komplexy, atd.) ^[1],^[2]

Kapacitace je často spojená s jevem nazývaným hyperaktivace. Spermie změní charakter svého pohybu, asymetricky se zvětší vlnění bičíku (spermie se pohybuje rychleji a v kruhu), hyperaktivace může pomáhat spermii odpoutat se z oviduktálního rezervoáru a proniknout vajíčkem ^[3]

Spermie nekapacitují všechny najednou, po určité minimální době inkubace v tekutinách oviduktu (nebo v kapacitačním mediu při kapacitaci in vitro) se ustanoví populace kapacitovaných spermií (od 1-10% z počtu spermií, závislé na druhu i konkrétním jedinci), která se po určité době (než se spermie vyčerpají) udržuje ^[4]

Kapacitované spermie, které se nepotkají s vajíčkem po krátké době umírají.

Změny spojené s kapacitací lze rozdělit do tří skupin

• na povrchu, změny v proteinovém obalu spermie
• v cytoplazmatické membráně
• v cytoplazmě

Během kapacitace dochází ke změnám v proteinovém složení povrchu spermií. Proteiny na povrchu spermií chrání spermii při průchodu samičím traktem a umožňují jí navázat se na stěnu oviduktu (vejcovodu) za vzniku oviduktálního reservoáru spermií. Díky tomuto rezervoáru se prodlouží životnost spermií v oviduktu a tím zvýší pravděpodobnost početí. V průběhu kapacitace spermie ztrácí schopnost vázat se na stěnu oviduktu.^[5]

• Během kapacitace dochází k odstraňování cholesterolu z membrány, zvyšuje se fluidita (tekutost) membrány, po odstranění určitých inhibičních proteinů dochází k aktivaci některých iontových kanálů ^[6]
• Dochází k porušení asymetrie složení membrány, fosfatidylethanolamin a fosfatidylserin se dostavávají do vnější vrstvy membrány.^[7],^[8]

Změny ve složení cytoplazmatické membrány vedou k destabilizaci membrány a tím připravují spermii na akrosomovou reakci a fúzi s vajíčkem

• Během kapacitace dochází k signalizační kaskádě, která připravuje spermii na kontakt a fúzi s vajíčkem. Dochází ke zvýšení koncentrace cytoplazmatického Ca^{2+ [9]}, HCO₃⁻. Zvýšená koncentrace HCO₃⁻ vede ke zvýšení pH uvnitř spermie a zvýšení koncentrace cAMP pomocí HCO₃⁻ dependentní (závislé) adenylyl cyklázy ^[10]. cAMP pak mimo jiné aktivuje PKA. Konečným výsledkem je fosforylace tyrosinu některých cytoplazmatických proteinů.^[11] Aktivita adenyly cyklázy je také zvýšená některými reaktivními kyslíkovými radikály (ROS - reaktive oxygen species) jako H₂O₂ , O₂⁻ a NO^.
• v cytoplazmě přítomný aktin G se pod vlivem HCO₃⁻ /cAMP/PKA (a částečně i PKC)/PLD signalizační dráhy začne polymerizovat na aktin F. Polymerizace aktinu vede k přesunu fosfolipázy C (PLC)z cytoplazmy do cytoplazmatické membrány. Během akrozomové reakce aktin F zpětně velmi rychle depolymeruje (umožní se tak kontakt cytoplazmatické membrány s vnější akrosomovou membránou) ^[12]

Po skončení kapacitace je spermie připravená na oplození vajíčka. Kapacitované spermie:

• vykazují schopnost chemotaxe a thermotaxe a díky tomu jsou schopné aktivně vyhledávát vajíčko.^[13],^[14]
• jsou schopné navázat se na glykoproteinový obal vajíčka – zonu pellucidu a podstoupit akrosomovou reakci.^[15]
  • po akrosmové reakci dojde k odhalení vnitřní akrosomové membrány, která obsahuje proteiny podílející se na fúzi spermie s vajíčkem ^[16]

Pro různé studie mechanismů savčího oplození a pro asistovanou reprodukci je zapotřebí spermie kapacitovat in vitro. Podstatou je odstranění semenné plazmy (tekutiny, ve které jsou spermie po ejakulaci) např. centrifugací a inkubace spermií v tzv, kapacitačním mediu, které napodobuje fyziologickou tekutinu v oviduktu. Kapacitačních medií je celá řada, společným rysem je přítomnost: Ca²⁺ , HCO₃⁻, sérového albumínu, zdroje energie ( glukosa, fruktosa, laktát, pyruvát) a správná osmomolarita (~300 mOsmol/kg)

Tyrodovo medium - příklad složení kapacitačního media

upravit pH připraveného roztoku na 7-7,5 a přidat 3mg BSA/ml (místo BSA je možno použít i jiné sérové albumíny příslušného druhu – např. HSA, PSA, ... )

Z ejakulátu se izolují spermie (např. centrifugací nebo swim up metodou) a rozředí se v kapacitačním mediu na koncentraci asi 3×10⁶ spermie/ml. Spermie se inkubují při 37-38 °C, v atmosféře 5% CO₂ (atmosféra obohacená CO₂ na 5%) a při 100% vlhkosti vzduchu po dobu, která je pro každý druh (i každého jedince) specifická (2-12 hod). Kapacitační stav spermií se vyhodnocuje pod mikroskopem. Nejčastějšími metodami jsou:

• analýza videa (hodnotí se specifický charakter pohybu spermií)
• indukce akrozomální reakce (pouze kapacitované spermie jsou schopné podstoupit akrozomální reakci)
• chlortetracyklinová (CTC) esej - během kapacitace se změní vazebná místa pro CTC na plazmatické membráně spermií. CTC je fluorofor a kapacitace se vyhodnocuje jako změna fluorescenčního vzoru na povrchu spermie.