El matrimoni amb Cosme I Mèdici es va organitzar, sense cap mena de dubte, no només pel seu gran dot sinó també per raons polítiques i dinàstiques.[1] Elionor descendia d'una de les famílies ben possicionades en el seu moment a la Corona de Castella i tenia grans vincles amb els Habsburg, especialment amb Carles V del Sacre Imperi Romanogermànic, del qual el seu pare n'estava al seu servei i posteriorment serví com a virrei de Nàpols. Amb aquesta aliança Carles V va poder mantenir les tropes espanyoles i imperials dins de la Toscana i fer front a qualsevol possible invasió francesa de la península italiana.
La parella va residir al principi a l'actual Palau Mèdici-Riccardi, traslladant-se posteriorment al Palazzo Vecchio, millorat i engrandit per a l'ocasió. Deu anys després de les noces, la parella es va traslladar a la seva nova residència del Palau Pitti, palau que fou comprat per iniciativa d'Elionor. Va ser una gran mecenes, protegint a artistes com Bronzino i Pontormo, augmentant enormement la col·lecció de pintura dels Mèdici, instal·lada actualment a la Galeria dels Uffizi.
Va morir a la ciutat de Pisa el 18 de desembre de 1562, població on s'havia traslladat a la recerca de l'ambient costaner, tractant així d'alleujar la malaltia pulmonar que sofria, i que finalment va posar fi a la seva vida.
