Di Nürnberg pada tanggal 29 November 1225 ia menikah dengan Heinrich, Raja Jerman yang terpilih dan putra sulung Kaisar Friedrich II. Calon mempelai pria hanya berusia empat belas tahun dan mempelai wanitanya berusia dua puluh satu tahun.
Pelantikannya sebagai Ratu Jerman dilangsungkan enam belas bulan kemudian, pada tanggal 23 Maret 1227 di Aachen. Heinrich dan Margarete memiliki dua orang putra, Heinrich (yang mati muda pada sekitar tahun 1242/1245) dan Friedrich (yang juga mati muda pada sekitar tahun 1251/1252).
Pada tahun 1235, Heinrich memberontak melawan ayahandanya, namun ia dikalahkan dan digulingkan. Terkurung di dalam beberapa kastil di Apulia, ia meninggal kemungkinan pada tanggal 12 Februari 1242 setelah jatuh dari kudanya, kemungkinan mencoba untuk bunuh diri. Sementara itu, Margarete (yang mungkin tidak pernah melihat suaminya lagi) pindah ke Würzburg, dimana ia tinggal di pengasingan di Markuskloster.
Saudara Margarete Friedrich II dari Austria, Adipati terakhir dari wangsa Babenberg, wafat tanpa keturunan di medan Pertempuran Leitha (1246), meninggalkan suatu krisis suksesi. Kedua penuntut kerajaan atas suksesi di dalam provinsi Austria dan Stiria merupakan seorang suami dari dua orang wanita: suami Margarete (yang sebagai saudari tertua adipati yang terakhir, menuntut hubungan darah yang dekat) dan suami keponakan Margarete Gertrud, yang menuntut hal anak yang sulung, sebagai putri tunggal Heinrich dari Mödling, saudara tertua Adipati Friedrich II (yang telah mendahului ayahandanya, Adipati Luitpold VI).
Václav I, Raja Bohemia ingin mengambil alih kekuasaan atas wilayah adipati dengan pernikahan putra sulung dan ahli warisnya, Vladislav dengan Gertrud. Pasangan tersebut diumumkan sebagai Adipati dan Adipati Wanita Austria, namun Vladislav meninggal pada tahun berikutnya (1247). Pemimpin Austria selanjutnya adalah suami kedua Gertrud, Hermann VI dari Baden, yang meninggal pada tahun 1250, meninggalkan Austria dan Stiria tanpa seorang pemimpin sekali lagi.
Aristokrat Austria menawarkan pemerintahan provinsi kepada Ottokar II dari Bohemia, putra kedua dan calon pewaris Raja Václav I. Akan tetapi, satu syarat diberikan oleh para bangsawan: Ottokar hanya dapat mengendalikan Austria dan Stiria jika ia menikahi seseorang dari pewaris Babenberg. Ottokar menolak suatu pernikahan dengan janda saudaranya dan memutuskan untuk menikahi Margarete. Pesta pernikahan itu dilangsungkan pada tanggal 11 Februari 1252 di dalam Kapel Puri (Jerman: Burgkapelle), Hainburg an der Donau. Calon mempelai wanitanya berusia 26 tahun lebih tua darinya.
Ottokar mendapat stempel hak istimewa kerajaana dengan seekor Banteng Emas pada basis Privilegium Minus, yang mensahkan tuntutannya atas wilayah adipati Austria dan Stiria, karena Margaret merupakan pewaris adipati yang terakhir yang dekat hubungan darahnya. Dengan demikian ia memindahkan pemerintahan wilayah adipati Austria dan Stiria kepada suaminya. Paus Innosensius IV, yang sebelumnya berpindah pihak beberapa kali antara Gertrud dan Margarete, menkonfirmasikan pemerintahan Margarete yang sah dan Ottokar atas baik wilayah adipati pada tanggal 6 Mei 1252. Administrator Bohemia memerintah wilayah adipati tersebut dengan nama mereka sendiri.
Setahun kemudian, pada tanggal 23 September 1253, Raja Václav I mangkat. Ottokar menjadi Raja Bohemia sebagai Ottokar II dan Margaret menjadi Permaisurinya. Akan tetapi, pada saat itu, terbukti bahwa Margarete (yang telah berusia 50 tahun), mandul. Raja Ottokar II mencoba untuk mendapatkan izin dari Paus untuk mengakui anak haramnya yang ia miliki dari salah satu pelayan Margarete sebagai pewaris sahnya. Setelah Paus menolak hal tersebut, pada tahun 1261 Raja mendapatkan pembatalan pernikahannya dengan Margarete. Ratu yang diabaikan itu meninggalkan Bohemia dan kembali ke Austria, ia tinggal di Krumau am Kamp dan selama musim dingin di Krems.
Ottokar II menyimpan Austria, Stiria, Kärnten, dan Carniola, menuntut sebagai pewaris yang ditunjuk oleh Margarete di dalam perjanjian cerainya. Ia memegang wilayah adipati tersebut sampai digulingkan oleh Raja Rudolf I dari Jerman pada tahun 1276.
Setelah bercerai ia dipanggil Romanorum quondam Regina (Ratu Romawi); akan tetapi ia tetap menyimpan gelar ducissa Austrie et Stirie (Adipati Wanita Austria dan Stiria). Pada tahun 1266 ia mengganti gelarnya sebagai quondam filia Livpoldi illustris ducis Austrie et Stirie et Romanorum Regina sebagai sebuah referensi ayahandanya.
Sebelum ajal menjemputnya, ia memilih Biara Lilienfeld sebagai tempat pemakamannya. Tanggal kematiannya kontroversial. Beberapa sumber menyatakan tahun 1266, dan yang lainnya menyatakan 2/12 Oktober 1267 sebagai tanggal yang sebenarnya. Sesuai dengan permintaannya, ia dimakamkan di Biara Lilienfeld di sisi makam ayahandanya.
Karl Lechner: Die Babenberger. Markgrafen und Herzoge von Österreich 976–1246. In: Institut für Österreichische Geschichtsforschung, Wien (Hrsg.): Veröffentlichungen des Instituts für Österreichische Geschichtsforschung. 6., Band 23, Böhlau, Vienna / Köln / Weimar 1996, ISBN 3-205-98569-9.